Thèse de Biochimie appliquée présentée à Université des sciences et techniques de Lille
pour obtenir le grade de Docteur-ingénieur

par

Jean-Pierre Rémy

Métabolisme intermédiaire d'Aspergillus oryzae (Alhb.) Cohn. : étude de sa régulation et des ses rapports avec la production d'amylase

soutenue en octobre 1984 devant la commission d'examen :
Lacoste, L., président
Schwitzguebel, J. P., Goma, G., Verbert, A., et Delecourt, R., examinateurs

 

INTRODUCTION

Depuis que Takamine, en 1907, a exploité industriellement pour la première fois la "Takadiastase" la production d'enzymes par fermentation n'a cessé de connaître un essor croissant qui a non seulement permis d'améliorer la technologie de production et d'extraction, mais également de développer nos connaissances de la physiologie microbienne. Grâce à ces progrès une vingtaine d'enzymes ont connu une exploitation industrielle ce qui reste toutefois faible face aux potentiels que représentent les quelques 20 000 enzymes découvertes à ce jour. Il faut savoir qu'à l'heure actuelle la majorité de ces enzymes exploitées industriellement ne sont produites que par quelques espèces fongiques principalement des Aspergillus et par quelques espèces bactériennes. Le développement d'une nouvelle souche requiert en effet de longues et coûteuses études pour satisfaire au contrôle toxicologique.

On comprend dès lors que l'industrie mette l'accent sur l'optimisation des productions déjà existantes. Le patrimoine génétique de la souche utilisée, les caractéristiques physico-chimiques de l'enzyme produite, la technologie de fermentation et d'extraction, sont autant de points susceptibles d'être améliorés.

Par une meilleure compréhension de la physiologie de l'organisme utilisé il est également possible d'optimiser les procédés de fermentation. C'est ce dernier point qui a valu au laboratoire de Cryptogamie de l'Université des Sciences et Techniques de Lille 1 de se voir confier l'étude des facteurs impliqués dans la physiologie de biosynthèse de l'a-amylase chez A. oryzae. La souche utilisée dans cette fermentation ayant la particularité d'acidifier occasionnellement les milieux de culture, il nous a été demandé de définir les facteurs à l'origine de cette acidification et de déterminer les méthodes pour éviter cette acidification synonyme d'une perte de production.

MALARD (1981) par une étude comparée de deux souches d'A. oryzae, dont les aptitudes à bio synthétiser cette enzyme différaient fortement, a ébauché l'approche de ce problème. Notre travail consistera donc dans un premier temps à identifier les composés acides responsables de la chute de pH dans les milieux de culture, dans un second temps à déterminer les voies métaboliques responsables de leur accumulation et enfin dans un troisième temps nous envisagerons les moyens capables d'agir sur ce métabolisme pour optimiser la biosynthèse de l'a-amylase.

 

CONCLUSION GENERALE

En confiant ce travail au laboratoire de Cryptogamie de l'Université des Sciences et Techniques de Lille la Société Rapidase désirait éclairer les rapports liant la synthèse d'a amylase chez A. oryzae à l'acidification des milieux de culture rencontrée occasionnellement lors de cette fermentation. Cette chute de pH étant synonyme d'une baisse de production, l'objectif d'une telle étude était de déterminer les méthodes susceptibles d'éliminer ce risque.

Une première approche de ce problème avait permis par une étude comparée de deux souches A. oryzae de poser les problèmes relatifs à cette synthèse. Selon MALARD (1981) un métabolisme de type oxydatif serait favorable à la synthèse d'a amylase alors qu'un métabolisme de type réducteur au contraire entraînerait l'accumulation de composés acides aux dépens de cette synthèse.

Partant de cette hypothèse, notre premier souci fut d'identifier le ou les composés acides relargués dans les milieux de culture.

Il s'est avéré que pour les deux souches l'acide malique était responsable de la chute de pH enregistrée après 48 heures de culture, en fin de croissance nous avons également noté la présence d'acide a céto-glutarique. Pour élucider les éventuels liens existants entre cette accumulation d'acides organiques et la production d'a-amylase nous nous sommes attachés à déterminer la nature des voies métaboliques responsables de cette acidification.

Nous avons démontré que l'acide a-cétoglutarique s'accumulait suivant un processus commun aux deux souches, processus impliquant d'une part le glutamate de sodium composé entrant en forte concentration dans les milieux de culture et d’autre part la déficience de l'a-cétoglutarate déshydrogénase. Une partie de cet acide a cétoglutarique participe également à l'accumulation de l'acide malique mais nous avons vu que cette participation restait minoritaire.

Si l'accumulation de l'acide malique résulte également d'un mécanisme commun aux deux souches, nous avons par contre démontré que les causes en sont profondément différentes. Pour des raisons qui leur sont propres les souches BrBv IV et 1135 ne peuvent dans certaines conditions régénérer le NADH cytoplasmique par voie aérobie. Ce qui dans notre cas précis impose à ces deux souches la réoxydation du NADH par la malate déshydrogénase via la carboxylation en oxaloacétate de composés à trois atomes de carbone issus de la glycolyse. Aucune réaction n'étant susceptible de métaboliser rapidement le malate ainsi formé, celui-ci est accumulé et relargué dans les milieux de culture.

Chez la souche 1135, cette incapacité à réoxyder l'NADH exogène serait dû à son taux naturellement faible en enzymes NADH oxydase et NADH cytochrome c oxydoréductase alors que chez la souche BrBv IV le glucose présent dans les milieux de culture serait à l'origine de cette accumulation. Son action répressive sur les voies respiratoires conduit la souche. BrBv IV à utiliser un moyen de réoxydation de l'NADH identique à la souche 1135. La production d'a-amylase qui fait appel à une synthèse de novo d'm ARN est également affectée chez la souche BrBv IV par la présence de glucose alors que chez la souche 1135 cette synthèse reste faible quelque soit le substrat utilisé.

Cette souche apparaît donc comme un matériel peu propice à l'amélioration de la synthèse de l'a-amylase alors que chez la souche BrBv IV plusieurs méthodes peuvent être envisagées dans ce but.

Cette souche utilisée industriellement est particulièrement sensible à la répression catabolique exercée par le glucose, or les substrats utilisés en fermentation sont des polysaccharides dont la décomposition entraîne la formation de glucose. Ce glucose réduit la synthèse de l'a-amylase et provoque une chute de pH. Une sélection de mutant insensible à la répression catabolique pourrait être opérée par l'usage d'un composé tel que le 2-déoxyglucose et ainsi améliorerait de façon sensible la production de l'enzyme.

On peut également envisager l'apport du substrat à un taux limitant de façon à maintenir la concentration en glucose libre aussi faible que possible.

L'oxygène dissout, nous l'avons vu, joue un rôle déterminant dans l'accumulation des acides organiques, l'aération devra donc être ajustée pour favoriser une production d'a-amylase optimum associée à une accumulation d'acides organiques minimum.

La fusion des protoplastes déjà abordée par notre laboratoire pourra être utilisée pour amplifier le potentiel génétique de la souche BrBv IV.

L'incorporation à ces protoplastes de mitochondries de souches insensibles à la répression catabolique serait également d'un grand intérêt tant un niveau fondamental que dans ses implications industrielles.